新药申报时，药品质量标准的分析方法必须验证。药品生产工艺变更、制剂分组变更、修改原分析方法时，应验证质量标准分析方法。

一、方法验证问题分析

药物分析检验时对药品生产的GMP进行药物分析的方法验证是保证药物分析结果准确性的前提和基础，也是实现药物分析测试GMP的必然因素。在药物分析中构成检验方法验证，包括以下方面：

1、验证成功前提的分析方法：

(1)装置在确认、修改和有效期内

(2)受过训练的人员

(3)可靠稳定的对照组

(4)稳定稳定的实验试剂

(5)确认试验溶液的稳定性，在规定时间内不分解。

2、分析方法验证所需的验证内容：

(1)含量测定

(2)杂质含量的测定

(3)药物的定性分析

(4)药物含量均匀性的测定

(5)药物的微生物检测

(6)药物细菌内毒素的检测

验证内容

准确度：

准确度是用这种方法测量的结果与实际值或参考值接近的程度，以百分点回收率表示。测量回收率R(recovery)的具体方法可以用加法回收试验法测量。样品回收实验已经准确测定了药物含量P的实际样品已知A的比较品(或标准品)，用M测量。在数据要求：规定的范围内，至少对9次测量结果进行评估(例如，对准备程度高、中、低三种不同浓度样本各进行3次测量)

精确度：

(迭代、中精度和再现性精度是指在指定条件下，同一均匀样品多次采样，测量结果之间的接近程度。以偏差(d)、标准差(SD)、相对标准差(RSD)(变动系数、CV)表示。

(1)在重复(repeatability):等条件下，在同一分析师测量结果的准确度规定的范围内，对至少9次测量结果进行评估，例如，分别测量3次3种不同浓度的样品，或将测量结果浓度测量100%，至少6次。

(2)中等精度的同一个实验室，在不同的时间，不同的分析师用不同的设备得到的结果的精度。

(3)再现性(reproducibility)不同实验室、不同分析师测量结果的准确性。

(4)数据要求：必须报告SD、RSD和可靠限度。

唯一属性：

在可能存在其他成分(杂质、分解物、辅助材料等)的情况下，采用的方法可以准确测量测试物的特性，在存在共存物的情况下，可以反映对测试物的准确和专有测量能力，该方法用于复杂样品分析时，是指测量相互干扰的程度。

一般来说，通过分析添加了杂质、分解物、化学物质或安慰剂成分的样品而得到的分析结果与未添加上述成分的样品的测试结果进行比较，两组测试结果的差异是特质的。

鉴别反应——必须能够与能够共存的物质或结构相似的化合物区分开来，与分析的样品结构相似或组内的相关化合物必须作出消极反应

含量测定和杂质测定-色保法及其他方法应附有代表性的指导和特殊属性。图中要标明各组的位置，色谱的分离度要符合要求。

如果杂质可用，为了测定含量，可以在样品中加入杂质或辅助材料，调查测试结果是否受到干扰。在杂质测量的情况下，还可以在样品中加入一定量的杂质，调查杂质是否分离。

测试限制：

检查限度是指样品在确定的实验条件下，可以检测出测量物的最低浓度或含量。它是限额检查效能指标，不需要定量测量，只要指出高于或低于规定浓度即可。

非机械分析视觉法：用已知浓度的测量物测试稳定检测的最小浓度或量。

信噪比方法：是一种显示基线噪声的分析方法(仪器分析方法)，它将已知的低浓度采样测量信号与空采样测量信号进行比较，计算出可靠检测的最小浓度或量。一般来说，信噪比为3: 1或2: 1的相应浓度或注入仪器的数量决定了检测限制

也可以使用标准差方法。

空白值=0时；

测量背景10次以上，寻找标准差；

乘3倍；

从工作曲线中得出相应的浓度X，即方法的检出值。

空值不等于0。

测量背景10次以上，寻找标准差；

乘3倍；

在工作曲线上求3相应浓度x。

求出的相应浓度值加上空白值，就可以得到该方法的检测极限

定量限制(limit ofquantitation LOQ)

样品中测量的东西是指定量测量的最低量，结果必须有一定的精度和精度要求

一般来说，信噪比方法可以确定定量限度，一般来说，如果信噪比(S/N)为10: 1，则根据相应浓度或注入器的量来确定，可以估计仪器测量的空白背景响应标准差(SD)的10倍，然后通过实验确定方法的实际测量下限。

数量限制：

样品中测量的东西是指定量测量的最低量，结果必须有一定的精度和精度要求

一般来说，信噪比方法可以确定定量限度，一般来说，如果信噪比(S/N)为10: 1，则根据相应浓度或注入器的量来确定，可以估计仪器测量的空白背景响应标准差(SD)的10倍，然后通过实验确定方法的实际测量下限。

路线：

在设计范围内，测试结果与样品中测量水的浓度直接成比例的程度。路线通常使用最小二乘法处理数据来获取回归曲线的斜率。数据要求：至少需要5条浓度检查线，需要步骤。

注意：做线性时，应注意尽量做的点多一点、线性浓度范围宽一点，这样做的好处是：当你在准确度考察时，你做的回收率考察的浓度就大些，配制溶液时就容易操作些，否者，在你做线性考察时，你做的线性浓度范围不宽，那么你在考察回收率时，你采用加入法考察时的浓度变化范围不宽，操作浓度很难控制，造成实际操作困难。我碰到一个在做方法学研究的人，由于她在考察线性时，做的线性浓度不大，在做回收率时，加入后的量造成回收率浓度超出线性考察范围的浓度，我说那样是不行的。因为在做分析计算时又恰恰用了线性关系来计算，结果肯定是值得怀疑，结果是不能令人肯定的！（这是经验总结）

范围：

指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高、低限浓度或量的区间。范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果和要求确定。

•原料药和制剂含量测定范围为80%-120%；制剂含量均匀度范围为70%-130%；杂质测定应为被测杂质汇报值到限度的120%；溶出度应为测定范围的±20%，如规定了限度范围，应为下限的-20%至上限的+20%，例如缓释片1h<20%,7h>70%,则验证范围定为0-90%。

耐用性：

指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度;如果方法易受到分析条件的影响，或要求苛刻，应注明。典型的变动包括：分析溶液的稳定性，提取时间等。

二、药物分析的方法学验证事项

含量测定方法验证的接收标准

*容量分析法：用原料药精制品(含量>99.5％)或对照品考察方法的精密度，相对标准差一般应不大于0.2％；进行回收率试验。回收率一般在99.7～100.3％之间

*UV法：用适当浓度的精制品进行测定，其RSD一般不大于1％。制剂的测定，回收率一般应在98％～102％之间；线性：吸光度A一般在0.2～0.7，浓度点n＝5。用浓度c对A作线性回归处理，得一直线方程，r应达到0.9999(n＝5)，方程的截距应近于零含量测定方法验证的接收标准

*HPLC法：

*要求RSD<2％，回收率98％～102％之间。

*线性范围：用精制品配制一系列标准溶液，浓度点n应为5～7，用浓度c对峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，建立回归方程，r应大于0.999，截距应趋于零

分析方法验证步骤

*验证方案的制订

*验证目的、方法改进背景、

*提供的原料药和产品、仪器概要、试剂、对照品

*待验证的方法，项目，合格标准

*实施人员的培训

*参考文献

*验证的实施

*收集完整的验证过程记录和原始图谱

*复核

*验证报告

*评价该方法是否通过验证

方法确认和方法转移

*对新产品的方法验证通常在产品开发阶段完成；大规模生产后的验证通常包括方法确认和方法转移

*分析方法确认是指当国家标准或药典标准拟变化或已经变化时在本实验室进行的对所涉及产品是否适用的确认实验

*确认之前应对新旧方法进行核对，标明所有变更细节

*检验样品的信息（批号、规格),变更项目的接收标准

*确认试验的样品通常包括正常产品、稳定性产品

*方法转移指检验方法由转移方转移至接收方时进行的实验。

*流动相PH（±0.5)

*流动相组成(有机相±5%）

*色谱柱（同一厂家的三个批号，或两个不同厂家（同固定相和填充物，尺寸）

*温度（20-25C)和流速(±10%）

*检测波长(±5nm)

检验项目和验证内容总结

*鉴别试验除专属性、耐用性外，其它都不要求。

*杂质的限度检查除专属性、检测限、耐用性外，其它都不要求

*杂质的定量测定除检测限外，其它都要求。

*含量测定及溶出量测定除检测限、定量限外，其它都要求

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