近年来测序很火,很多实验室正在或已经完成了sRNA的测序工作,miRNA研究越来越火,然而,找公司设计引物合成引物真心贵(对于我们穷屌丝来说……)。本人自己动手琢磨了会,哎哟喂~效果良好!
好了不闲扯了,下面给大家分享一下我的方法。
miRNA引物设计(茎环法)原理:由于miRNA在20bp左右,没法根据其设计引物检测出来,于是,人们就先将其延长,也就是先加一个环状片段,这样就使得原来20bp左右的延伸为80bp左右了,然后就可以根据这个80bp片段设计引物啦。
具体操作:
需要三种引物:逆转录引物(RT-primer,用于延长miRNA的)、实时定量PCR上游引物、实时定量PCR通用下游引物。
1、逆转录引物
逆转录引物序列由5’端茎环结构引物和3’端miRNA特异性序列组成。“特异的反向引物约42-44个核苷酸,其5’端的36个核苷酸序列是固定的,形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构,其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。”5’端茎环结构通常固定,如5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3’ ;3’端特异性序列由与成熟的miRNA 3’端若干寡核苷酸反向互补配对所得。
即:逆转录引物为“5‘- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGNNNNNNNN-3’(N 为miRNA3’端反向互补的6-8个碱基)。
通俗地说就是,固定的颈环序列(网上很多或者用我这个也行)+miRNA末端6-8个反向互补碱基。
以 mmu-[size=14.6666669845581px]miR-16-5p ([size=13.3333330154419px]UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG) 颈环序列+末尾 8个碱基反向互补。即为 :
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGcgccaata
[size=13.3333330154419px]
2、实时定量PCR上游引物
上游引物包括5’端通用序列和3‘端miRNA特异序列,5’端通用序列为:5’-GCCGAG-3’或5’-TCGGCAGG-3’,用于延伸实时定量PCR产物的长度;3’端为跟据成熟miRNA自身碱基组成及GC含量适当删减几个碱基所得的寡核苷酸或完整的成熟miRNA。
即:上游引物为5‘- 通用引物+NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ ,自miRNA5’端抄起,14-16个或13-14个。
通俗的说就是:保护性碱基(用来调GC含量的)+miRNA 5 端的13-16个碱基(不要抄到最后那6-8个上去了,意思就是不要与RT那段重叠了)
3、实时定量PCR通用下游引物
下游通用引物:5’- CTCAACTGGTGTCGTGGA -3’ (茎环引物上取,可以挪)这个就更简单了,直接在颈环上摞一段即可,然后计算下gc完事。
嗯的,如果你有土豪boss罩着,可以忽略本文,找生物公司做引物设计。
来源:基迪奥生物